Wirkungsort / Wirkungsmechanismus

Chloramphenicol (CAM) ist ein potenter Hemmer der mikrobiellen Proteinsynthese sowie z.T. der mitochondrialen Proteinsynthese von sich schnell teilenden Zellen, wie die Knochenmarkzellen von Säugern (Watson 1991b; Papich 2001a; Watson 1980b; Poehlsgaard 2005a; Penny 1970a). Es bindet sich irreversibel an eine Rezeptorstelle auf der 50S-Untereinheit der bakteriellen Ribosomen und hemmt dabei ein Enzym (Ribozym), die Peptidyltransferase, welches ein integraler Teil der 50S-Untereinheit ist. Die Peptidyltransferase ist für die Katalyse von Peptidbindungen zuständig (Weisberger 1964b; Dowling 2006a). Die Hemmung der Peptidyltransferase erfolgt durch Blockierung der tRNA-Translokation an die A-Stelle (Schlünzen 2001a; Moazed 1987a; Rodriguez-Fonseca 1995a). Das Peptidyltransferasezentrum der 50S-Ribosomenuntereinheit von Bakterien ist auch Zielort von anderen Antibiotika: Makrolide, Linkosamide, Streptogramin B, Puromycin, Pleuromutiline und Oxazolidinone (Poehlsgaard 2005a). Eine Studie von Schlünzen et al. mit dem Eubakterium Deinococcus radiodurans führte zum Ergebnis, dass die Antibiotika-Bindungsstellen nur aus 23S rRNA-Segmenten bestehen und keine Interaktionen mit ribosomalen Proteinen involvieren.
 
CAM besitzt mehrere reaktive Gruppen, welche mit verschiedenen Nukleotiden der Peptidyltransferasestelle Wasserstoffbrücken eingehen: 2 Sauerstoffatome der para-NO₂-Gruppe, die 1OH-Gruppe, die 3OH-Gruppe und die 4'-Carboxylgruppe. Eines der beiden Sauerstoffatome der para-NO₂-Gruppe bildet Wasserstoffbrücken mit dem N4 der Base Cytosin der Stelle 2452 von E. coli und es wurde nachgewiesen, dass eine Mutation an dieser Stelle zur CAM-Resistenz führt. Das andere Sauerstoffatom interagiert mit dem 2'O der Base Uracil der Stelle 2504 von E. coli. Die 1OH-Gruppe des CAM befindet sich in einem für Wasserstoffbrücken geeigneten Abstand vom N2 der Base Guanin der Stelle 2061 der 23S rRNA von E. coli. Eine Mutation an diesem Nukleotid führt zur CAM-Resistenz bei Rattenmitochondrien und eine Mutation des benachbarten Nukleotids A2062 verleiht dem Bakterium Halobacterium halobium eine Resistenz. Die 3OH-Gruppe ist entscheidend für die Wirkung des CAM und befindet sich in einem für Wasserstoffbrücken geeigneten Abstand vom 4'O der Base Uracil der Stelle 2506 und vom 2'O der Base Guanin der Stelle 2505 von E. coli (Schlünzen 2001a). Die in-vivo-Modifizierung dieser OH-Gruppe führt zur Resistenz (Shaw 1991a). Die 4'-Carboxylgruppe scheint eine Wasserstoffbrücke mit dem 2'OH der Base Uracil an der Stelle U2506 von E. coli zu bilden (Schlünzen 2001a). In einer Studie wurde die spezifische Wechselwirkungsstelle mit dem Peptidyltransferasezentrum an den Nukleotiden 2497-2505 der 23S rRNA von E. coli identifiziert (Marconi 1990a). Zusätzlich zu den Wechselwirkungen zwischen dem CAM und den RNA-Nukleotiden wird angenommen, dass 2 hydratierte Ionen (Mg-C1 und Mg-C2) an der Bindung des CAM beteiligt sind und die Interaktion mit der Peptidyltransferasevertiefung stabilisieren. Aufgrund der verwendeten Untersuchungsmethode konnte aber nicht ausgeschlossen werden, dass es sich nicht um K⁺ oder NH₄⁺ handelt (Schlünzen 2001a). 1967 berichteten Armentrout und Weisberger auch über eine Beeinflussung der CAM-Wirkung in Abhängigkeit der Mg²⁺-Konzentration. Mit 0,1 mM CAM und 6 mM Mg²⁺ kam es zur vollständigen Hemmung der Proteinsynthese in einem zellfreien System. Die Hemmung der Proteinsynthese war streng von der vorhandenen Mg²⁺-Konzentration abhängig. Mit hohen Mg²⁺-Mengen wurde die Proteinsynthese weniger gehemmt (Armentrout 1967a).
 
Es gibt mehrere Berichte, die das Vorhandensein von 2 Chloramphenicol-Bindungsstellen postulieren; eine mit einer höheren Affinität als die andere (Contreras 1977a; Lessard 1972a; Hansen 2003a). Andere Autoren berichten hingegen über das Vorhandensein von nur einer Bindungsstelle pro Ribosom (Contreras 1977a; Fernandez-Munoz 1971a; Wolfe 1965a).
 

Wirkspektrum

Chloramphenicol (CAM) ist wirksam gegen ein breites Spektrum an grampositiven und gramnegativen Bakterien, inklusive der meisten obligaten Anaerobier (Watson 1991b). Unter den grampositiven aeroben Organismen sind u.a. viele Streptococci und Staphylococci empfindlich. Eine Wirkung besteht auch gegen gewisse gramnegative Aerobier, inklusive Neisseria, Brucella, Shigella und Haemophilus. Viele anaerobe Bakterien sind empfindlich auf CAM, inklusive Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium, und Veillonella. CAM wirkt zusätzlich gegen Nocardia, Chlamydia, Mycoplasma und Rickettsia (Plumb 2002a). E. coli, Proteus vulgaris und Salmonella spp. können empfindlich sein, aber Resistenzen treten bei vielen gramnegativen Bakterien auf, insbesondere unter den Enterobacteriaceae. Bei den Staphylococci ist bei vermehrter Anwendung eine Resistenzentwicklung möglich (Papich 2001a).
 

MIC

Empfindlichkeit von gewissen Bakterien in-vivo gegenüber CAM in µg/ml:
 

Bacillus anthracis	2,5 - 5,0 (Hird 1986a)
Bacteroides spp.	1,0 - 8,0 (Hird 1986a)
Corynebacterium spp.	0,5 - 3,0 (Hird 1986a)
E. coli	0,8 - 8,0 (Hird 1986a)
	2 - 8 (Lindberg 1966a)
Haemophilus influenzae	0,2 - 0,5 (Hird 1986a)
Pasteurella spp.	0,2 - 10,0 (Hird 1986a)
Proteus spp.	2,5 - 64 (Hird 1986a)
	4 - 64 (Lindberg 1966a)
Pseudomonas aeruginosa	50 - 125 (Hird 1986a)
Salmonella spp.	0,5 - 10,0 (Hird 1986a)
S. typhi	2,0 - 4,0 (Hird 1986a)
Staphylococcus aureus	4,0 - 12,0 (Hird 1986a)
Streptococcus faecalis	125 (Miyamura 1977a)
	2 (Lindberg 1966a)
Strept. haemolyticus	31,2 (Miyamura 1977a)
Strept. pneumoniae	1,0 - 4,0 (Hird 1986a)
	31,2 (Miyamura 1977a)

 
MICs von gramnegativen pathogenen Bakterien aus Kotproben von Pferden (Adamson 1985a):
 

Keim	MIC50 [µg/ml]	MIC90 [µg/ml]
Actinobacillus sp. (n=6)	1	16
Enterobacter cloacae (n=4)	64	>128
Escherichia coli (n=10)	8	16
Klebsiella pneumoniae (n=10)	16	>128
Pseudomonas aeruginosa (n=10)	>128	>128
Salmonella sp. (n=11)	16	>128
Corynebacterium (Rhodococcus) equi (n=10)	8	16
Corynebacterium pseudotuberculosis (n=8)	4	4
Streptococcus equi (n=11)	2	2
Koagulase-positive Staphylococcus sp. (n=7)	8	8
Streptococcus zooepidemicus (n=12)	2	2

 
MIC₉₀ von verschiedenen Bakterien und Mykoplasmen (Dowling 2006a):
 

Keim	MIC90 [µg/ml]
Grampositive aerobe Keime
Arcanobacterium pyogenes	1
Bacillus anthracis	2
Corynebacterium renale	4
Enterococcus spp.	> 32
Erysipelothrix rhusiopathiae	2
Listeria monocytogenes	8
Staphylococcus aureus	8
Streptococcus dysgalactiae	4
Streptococcus uberis	2
Gramnegative aerobe Keime
Actinobacillus spp.	4
Bordetella bronchiseptica	8
Brucella canis	4
Enterobacter spp.	> 32
Escherichia coli	> 32
Histophilus somni	1
Klebsiella spp.	> 32
Pasteurella spp.	> 32
P. multocida	2
Mannheimia haemolytica	2
Proteus spp.	> 32
Pseudomonas aeruginosa	> 32
Anaerobier
Bacteroides spp.	8
B. fragilis	8
Clostridium difficile	4
Cl. perfringens	4
Dichelobacter nodosus	0,25
Fusobacterium spp.	1
F. necrophorum	2
Brachyspira hyodysenteriae	4
Mykoplasmen
M. bovis	8
M. bovirhinis	64
M. canis	8
M. hyopneumoniae	4
M. ovipneumoniae	16

 

Weitere empfindliche Bakterien

Bakterien mit einem MIC ≤ 8 µg/ml:
Grampositive Aerobier: Actinomyces spp., Corynebacterium spp., viele Staphylococcus spp. und Streptococcus spp.
Gramnegative Aerobier: Salmonella spp., Haemophilus spp., Leptospira spp., Moraxella spp. und Mannheimia spp.
Anaerobier: Clostridien spp., Prevotella spp. und Porphyromonas spp.
 
Intermediär empfindlicher Keim mit MIC = 16 µg/ml:
Rhodococcus equi
 
Resistente Organismen (MIC ≥ 32 µg/ml):
Mycobacterium spp. und Nocardia spp.
 
Unter den gramnegativen enterischen Bakterien kommt es oft zur Bildung von Resistenzen (Dowling 2006a).
 

Resistenzen

Natürlich vorkommende und erworbene CAM-Resistenzen sind, in-vitro und in-vivo, in Stämmen von Staphylococcus, Salmonella, Shigella und Escherichia coli beschrieben. Resistente Stämme von Haemophilus influenzae wurden nur selten nachgewiesen (McEvoy 1992a). Gewisse E. coli können ihre CAM-Resistenz verlieren, entweder durch mehrere Mutationen mit folgender Selektion (häufigster Mechanismus) oder durch eine physiologische Anpassung (Herrmann 1953a).
 
Es gibt Berichte bezüglich der Übertragung von CAM-Resistenzen vom Tier zum Menschen, v.a. unter den Salmonellen (Holmberg 1984a; Lyons 1980b).
 
Es wurden mindestens 4 CAM-Resistenzmechanismen beschrieben (Papich 2001a):
 
1) Plasmid-kodierte Resistenz durch die Chloramphenicolazetyltransferase
2) Änderung der bakteriellen Zellwandpermeabilität
3) Änderung der Bindungsfähigkeit an die 50S-Ribosomenuntereinheit
4) Inaktivierung durch Nitroreduktion
 
Es wurden zudem Efflux-Proteine (Efflux-Pumpen) beschrieben (Schwarz 2004a).
 

Chloramphenicolazetyltransferase (CAT)

Die enzymatische Antibiotikainaktivierung ist der häufigste Mechanismus der Resistenz gegenüber einem Antibiotikum unter den Bakterien (Shaw 1991a). Die Plasmid-vermittelte Resistenz, durch das Vorhandensein von CAT in den resistenten Bakterien, ist der wichtigste Resistenzmechanismus gegenüber CAM (Yunis 1988a).
 
Die CAT, ein Trimer, katalysiert die Übertragung der Azetylgruppe vom Azetylkoenzym A an die C-3' OH-Gruppe des Antibiotikums. Eine langsame spontane Übertragung der Azetylgruppe vom C-3' an die C-1'-Stelle, ermöglicht eine 2. Azetylierung an der C-3'-Stelle, was zum 1',3'-Diazetylchloramphenicol führt (Shaw 1991a). Dieses Produkt ist antibiotisch unwirksam, da es nicht mehr an bakterielle Ribosomen binden kann (Vining 1995a). Diese zweite Azetylierung ist für eine Resistenzentstehung nicht zwingend nötig, da bereits durch eine C-3'-Azetylierung das Wirkstoffmolekül seine antibiotische Aktivität verliert (Shaw 1991a); siehe auch Wirkungsmechanismus.
 
CAM bindet an die CAT in einer tiefen Grube, welche von mehreren Untereinheiten gebildet wird. Das für die Katalyse essentielle Histidin 195 ist so platziert, dass ein einziger Monomer alleine katalytisch unwirksam ist. Bei der Bindung mit dem CAM sind sowohl hydrophobe als auch polare Strukturen involviert; dies wiederspiegelt die amphiphile Natur des CAM-Moleküls. Nur 2 direkte Wasserstoffbrücken verbinden das Enzym mit dem CAM: die eine befindet sich zwischen dem Tyrosin 25 der CAT und dem CAM, die andere zwischen dem Histidin 195 und dem CAM.
 
Alle beschriebenen CAT-Varianten zeigen eine sehr ähnliche Affinität für das CAM, wobei ihre katalytische Wirksamkeit unterschiedlich ist (Shaw 1991a). In einer Studie wurde die CAT von S. aureus mit derjenigen von E. coli verglichen: ihr Molekulargewicht (ca. 78'000) und ihr pH-Optimum (7,8) sind gleich, aber ihre Hitzestabilität, elektrophoretische Mobilität und immunologische Reaktivität sind unterschiedlich (Shaw 1968a).
 
Der grösste Teil der Eubakterien, welche resistent gegen CAM sind, besitzen CAT-Gene (Shaw 1992a). Bei der Untersuchung resistenter gramnegativer Bakterien wurde das CAT-Gen auf konjugativen R-Plasmiden identifiziert, die meist mehrere Wirkstoffresistenzen aufwiesen (Foster 1973a). Die Resistenzdeterminante auf dem R-Plasmid ist meist ein Transposon Tn9 oder eine seiner Varianten (Iida 1983a). Tn9 wurde im Genom von Phage P1 gefunden (Kondo 1970a), sowie auf dem Chromosom von Proteus mirabilis (Shaw 1971a). Generell haben Enterobakterien, welche CAT Typ I bilden, die höchsten MICs (125 - 325 µg/ml); Typ II die tiefsten (75 - 150 µg/ml) und Typ III intermediäre (150 - 200 µg/ml) Werte (Zaidenzaig 1976a). Es gibt auch noch andere CAT-Varianten als die der Enterobakterien, welche bei anderen gramnegativen Bakterien vorkommen (Zaidenzaig 1979a). Bei den grampositiven Bakterien wurde die Genetik und Enzymologie der CAT v.a. bei S. aureus und S. epidermidis gut erforscht (Sands 1973a; Shaw 1970a). Ein isoliertes Plasmid pC194 von S. aureus kodiert eine induzierbare CAT, welche als CATc bezeichnet wird (Löfdahl 1978a). Die CAT von Staphylokokken ist unterscheidbar von derjenigen enterischer Bakterien; sie ist u.a. induzierbar und weniger hitzelabil. CATc macht keine immunologische Kreuzreaktionen mit enterischen Enzymen und kann mit tiefen CAM-Konzentrationen schnell induziert werden. Bei hohen Konzentrationen gibt es eine Verzögerung, da die CAM-Konzentration durch die langsam gebildete CAT abnimmt. Auch andere Moleküle als CAM können die CATc-Produktion induzieren, wie z.B. 3-Deoxychloramphenicol und C-3-Fluoroderivate. Dies zeigt, dass die C-3-Hydroxyl-Gruppe nicht essentiel für die Enzyminduktion ist (Smith 1984b). Die CAT-Bildung in anderen grampositiven Organismen wurde weniger gut beschrieben (Smith 1984b). Bacillus pulmis zeigte in einer Studie von Keggins et al. eine geringe Resistenz gegenüber CAM und besass eine Chromosomen-vermittelte CAT (Keggins 1978a). Eine Resistenz durch CAT-Aktivität wurde auch bei Clostridium perfringens beschrieben. Bei Strept. pneumoniae wurde eine CAT gefunden, welche ähnlich zum enterischen Typ II Enzym ist. Die CAT von Strept. agalactiae führte zu einer immunologischen Kreuzreaktion mit der CAT von Staphylokokken (Zaidenzaig 1979a). In Strept. faecalis fanden Nakagawa et al. eine Plasmid-kodierte CAT, welche Gemeinsamkeiten mit dem Typ D Enzym von Staphylokokken aufwies (Nakagawa 1979a).
 

Änderung der bakteriellen Zellwandpermeabilität

Vasquez fand als Erster einen CAM-resistenten E. coli-Stamm mit herabgesetzter Permeabilität für das CAM (Vazquez 1964a). Dieser Resistenzmechanismus wurde in E. coli (Gaffney 1981a; Vazquez 1964a), H. influenzae (Burns 1985a) und Pseudomonas aeruginosa (Kono 1976a) beschrieben. Bei E. coli (Unowsky 1966a; Gaffney 1981a; Nagai 1972a) und Ps. aeruginosa (Kono 1976a; Wareham 2002a) wurde eine R-Plasmid- und eine Chromosomen-vermittelte Resistenz, die zu einer herabgesetzten Aufnahme von CAM führt, beschrieben (Yunis 1988a). Die meisten Experimente zur Erforschung der Permeabilitätsbarriere wurden mit E. coli durchgeführt (Smith 1984b). Burns et al. beschrieben eine vermutlich chromosomale Resistenzdeterminante in H. influenzae-Stämmen. Bei der Analyse der äusseren Membranproteine fanden sie bei den resistenten Bakterien eine Abnahme der 40 kD Porine (Burns 1985a). Hingegen wurde in einer anderen Studie von Burns et al. berichtet, dass bei gewissen CAM-resistenten Ps. cepacia-Stämmen, deren äussere Zellwand impermeabel für das CAM war, keine strukturellen Änderungen in den äusseren Membranproteinen (inkl. Porine) oder den LPS (Lipopolysaccharide) vorhanden waren. Sie folgern, dass die wahrscheinlichsten Resistenzmechanismen strukturelle oder funktionelle Veränderungen sind, lokalisiert in der intakten äusseren Membran (Burns 1989b). Bei E. coli wurde ein Transposon vermitteltes Resistenzgen, welches von einem Pseudomonas aeruginosa Plasmid isoliert wurde, beschrieben. Dieses verursacht eine CAM-Permeabilitätsbarriere durch den Verlust eines 50'000 Da Proteins in der äusseren Membran (Burns 1986a).
 

Chloramphenicol-Resistenz auf ribosomalem Niveau

Osawa et al. haben eine Gruppe von 6 CAM-resistenten Mutanten von Bacillus subtilis beschrieben. Alle hatten veränderte Polypeptide in der 50S-Ribosomenuntereinheit und 3 von 6 wiesen eine herabgesetzte CAM-Bindung auf (Osawa 1973a). Über das Vorkommen von CAM-Resistenzen auf ribosomalem Niveau bei B. subtilis berichteten auch Anderson et al. (Anderson 1984d). In einem weiteren Bericht wurde eine Mutation bei E. coli K12, die zu CAM-Resistenz führt, beschrieben; das Resistenzgen kodiert ribosomale Proteine (Baughman 1979a).
 

Inaktivierung durch Nitroreduktion

Diese Inaktivierung findet v.a. bei Anaerobiern statt. Das Versagen einer CAM-Therapie bei einer Infektion mit Bacillus fragilis beim Menschen wurde diesem Mechanismus zugeordnet (Yunis 1988a). CAM kann in-vitro von Bacteroides spp. und Clostridium spp. schnell inaktiviert werden (Onderdonk 1979a), wobei gewisse Bacillus subtilis-Stämme das CAM auch mit der CAT inaktivieren können (Britz 1978a). Es existieren also beide Mechanismen unter den Bacteroides. Die relative Bedeutung der beiden Mechanismen für die Klinik ist nicht bekannt, aber beide können zum Versagen einer CAM-Therapie führen (Yunis 1988a). Bacillus fragilis und Clostridium perfringens reduzieren das CAM zu einer biologisch inaktiven Aminophenylverbindung (Onderdonk 1979a).
 

Transporter (Efflux-Pumpen)

CAM kann auch durch spezifische oder Multidrug-Transporter aus der Zelle exportiert werden (Dowling 2006a); beide Typen können gleichzeitig vorkommen (Schwarz 2004a). Die spezifischen Transporter können nur eine kleine Anzahl von ähnlichen Verbindungen befördern, hingegen weisen die Multidrug-Transporter ein breites Spektrum an Substraten auf. Spezifische Transporter vermitteln aber oft eine höhere Resistenz im Vergleich zu Multidrug-Transportern. Viele der Gene, welche für CAT oder für spezifische Transporter kodieren, befinden sich auf mobilen genetischen Elementen, wie Plasmiden, Transposonen oder Integronen (Dowling 2006a). 1979 wurde bei Ps. aeruginosa (Rubens 1979a) der erste spezifische Transporter beschrieben. Es handelt sich um das Protein 419 mit 12 transmembranären Domänen, welches durch das Gen cmlA kodiert wird (George 2002b). Beispiele von Multidrug-Transportern sind NorA bei S. aureus (Yoshida 1990a) und Blt bei B. subtilis (Ahmed 1995a).